Post by jone447 on Aug 2, 2023 1:54:59 GMT -5
育 15 分钟。通过 SDS-PAGE 分离与 RBP-RNA 复合物相对应的放射性标记条带，并将其转移到硝酸纤维素膜上，进行检测并切下。将膜片在含有 1 mg/ml 蛋白酶 K 的蛋白酶 K 缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，75 mM NaCl，5 mM EDTA，1%（w/v）SDS）中孵育，并在 50 °C 下孵育 30 分钟。通过酸性苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀回收RNA。在反转录和 PCR 扩增之
前，通过连接预腺苷酸化的 3'接头和 5' 接头 RNA 来亚洲手机号码列表制备 cDNA 文库。从 2.5% 琼脂糖凝胶中切出对应于连接到两个接头的插入片段的 PCR 产物，并使用 Qiaquick 凝胶纯化试剂盒进行纯化。扩增和纯化的 cDNA 提交洛克菲勒大学基因组中心进行测序。使用 PAR-CLIP 套件分析数据5和PARalyzer 78、79。 _ 源数据中列出
两次重复的结果。补充方法中提供了详细的分步方案。 基序分析 使用 MEME 套件 MEME 进行基序分析，计算 4 聚体到 8 聚体的富集，以定义 3'UTR 中前 1000 个基序和 PARalyzer 定义的内含子，其至少有 10 个读段。 荧光素酶测定 从 WT 小鼠的基因组 DNA 中 PCR 扩增 WT Insig2 3'UTR（fw 引物：并使用限制性位点 XhoI 和 NotI (NEB)克